Gas Chromatography의 기초
 
　
 
크로마토그래피란 두 가지 이상의 성분이 혼합된 물질을 단일성분으로 분리하는 기법으로서 Stationary phase(고정상)과 Mobile phase(이동상)을 이용하여 물질을 분리한다. 물질의 분자적인 특성은 고정상에 머무르려는 성질과 이동상에 머무르려는 성질의 정도에 따라서 다르게 분포하게 되는데, 이 분포의 차이에 의하여 분리가 이루어지는 것이다.
 
 
 
　
 
 역사
 
　
 
크로마토그래피는 1850년경 F. F. Runge가 염료를 분리한 것으로부터 비롯되었다. 이 과정에서는 여과지와 용매가 사용되었는데, Runge는 여과지에 대한 염료의 친화성 정도와 분자량의 차이를 이용하여 여러가지 염료를 분리하였다.
 
 
 
1906년 M. Tsweet는 흡착제를 충전시킨 Glass Column(유리분리관)을 사용하여 식물의 색소물질을 분리하였으며, 이 과정을color-writing(색 기록)이라는 의미로 chromatography(크로마토그래피)라고 명명하였다. 이 기법에서는 또한 충전물에 흡착된 물질의 제거를 위하여 액체 이동상을 사용하였으며 탈착된 물질은 이동상의 흐름에 따라 용리되어 Column(분리관)의 끝부분에서 수거되도록 하였다.

　
 
1941년 Martin과 Synge는 처음으로 크로마토그래프 장치에서 이동상으로 기체의 사용 가능성을 제안하였으나 이론에 그치고 실행되지는 못하였다.
 
 
 
최초의 기체 크로마토그래프 장치는 1952년 Martin과 James에 의하여 개발된 것으로 산과 염기의 검출과 정량을 위하여 자동 Burette이 설치된 것이었다. 이와 같이 최초의 기체크로마토그래프는 분석 대상이 산과 염기 두 기능그룹에만 제한되었으며, 1954년 Ray가 처음으로 Chromatogram(크로마토그램)을 발표하고 나서야 비로소 기체 크로마토그래피의 응용 가능성이 구체화되었다. 그가 사용하였던 검출기는 열전도(thermal conductivity)를 이용한 것으로, 오늘날에도 널리 사용되고 있다. 1955년경이 되어서야 비로소 GC(기체크로마토그래프) 기기가 시판되기 시작하였다.
 
　
 
 
 
 기체크로마토그래프의 구성
 
 
 
 
 
 
 
기체 크로마토그래프는 일정한 압력의 Carriet gas(이동상)를 이용한다. 시료가 주입기(주로 syringe)를 통하여 Injection Port(주입부)로 통하게 되면 주입부의 온도에 의하여 기화하게 된다. 기화된 시료는 Carrier gas(운반기체)와 함께 Column으로 이동하게 된다. Column내에서 고정상과 시료간의 상호 반응에 의해, 분포를 달리하게 되며 Carrier gas와 함께 검출기에 이른다. 검출기에 도달한 시료 성분은 전기적 신호로 변환되어 기록기에 의하여 값이 측정된다.
 
 
 
　
 
 
　
 
 Carrier gas(운반기체)
 
 
 
가장 일반적으로 사용되는 운반기체로는 He(헬륨), H2(수소), N2(질소), Ar(아르곤) 등이 있다. 운반기체의 선택에서 고려해야 할 가장 중요한 점은 사용할 Detector(검출기)의 특성이다. 예를 들면  Thermal Conductivity Detector(TCD:열전도도검출기)의 경우 운반기체가 헬륨이나 수소일 때에는 좋은 결과를 보이지만, 질소를 사용하게 되면 감도가 많이 감소하게 된다.
 
 
 
운반기체는 다음의 조건을 갖추어야 한다.

 1) 비활성일 것
 2) 건조할 것
 3) 순수할 것
 
 
 
위에서 언급되었던 기체들은 대부분의 경우에 시료와 분리관의 고정상 등에 대하여 활성이 없다. 그러나 건조해야 한다는 조건에는 약간의 어려움이 있는데, 대부분의 운반 기체들이 물 펌프를 사용하는 과정에서 실린더 내로 수분이 들어가게 된다. 시판되는 기체들은 실린더와 크로마토그래프 사이에 분자 체 Trap(Molecular Sieve Trap)을 설치해야 하며, 분자 체 Trap은 건조시켜 사용하여야 한다(주기적으로 실시하는데 운반기체를 흘려보내면서 4시간 동안 300℃로 가열한다). 운반기체에 수분이 함유되어 있을 때, 이런 상태의 기체를 그대로 흘려 보내면 수분이 Column  충전물과 상호작용을 일으켜 정확한 크로마토그램을 얻을 수 없게 되며 피크의 모양이 이상하거나 ghost peak(유령피크)가 나타나게 된다. 또한 운반 기체에 수분이 함유되어 있으면 Column 자체의 수명도 단축시키게 된다.
　
 
불순물이 함유되어 있는 운반 기체를 사용하는 경우, 수분이 함유된 운반기체를 사용할 때와 마찬가지로 문제가 발생한다. 크로마토그램의 바탕선이 상승되는 현상(baseline drift)과 바탕선상에 톱니모양의 아주 작은 피크들이 연속적으로 나타나는 바탕선 잡음(noise)이 그 대표적인 예이다.

　
 
불순물 함유 정도는 기계의 감도를 손상시키지 않는 정도로 낮아야 할 것이며, 가능한 한 순도가 높은 기체를 사용하는 것이 바람직하다.
 
 
 
　
 
 Injection(주입부)
 
 
 
시료 주입부는 시료를 운반기체에 실어 Column으로 보내주는 역할을 한다. Gas Chromatography에서 주입부는 가열된 상태에서 비기체상의 시료를 기화시켜야 하므로 온도 조절을 할 수 있도록 설계되어 있으며, 또한 주사기, 고체시료주입기, pyrolyzer(열분해장치) 등의 여러 가지 시료 주입 장치들이 사용될 수 있도록 되어 있다. 현재는 크로마토그래프의 약 80%가 액체시료를 사용하고 있어서 대부분이 microliter sylinge(마이크로 주사기)를 이용한 액체시료의 주입을 가정하여 기기가 디자인되어 있다.
 
 
 
크로마토그래프의 내부와 외부 환경은 주입부의 셉텀이라고 하는 실리콘 고무로 유일하게 분리되어 있다. 따라서 Septum의 파손은 곧 실험에서 외부의 환경을 받는다는 뜻이 된다. 또한 Septum 자체의 손상으로 인해 실험에 영향을 받기도 한다. 저휘발성 물질의 분석시에 주입부의 온도를 높게 설정하는 경우, septum bleed(Septum 녹아내림현상)이나 시료의 분해현상이 일어나므로 녹아내림이 적은 Septum을 사용해야 하고, 시료에 따라서는 Septum이 흡수하는 경우도 있으므로 이런 경우에는Teflon이 대어져 있는 Septum을 사용하는 등 목적에 맞게 Septum을 선택해야 한다. Septum Bleed 현상은 Detector의 바탕값을 상승시키고 온도프로그램된 경우에 Ghost peak(유령피크)가 검출되어 분석에 영향을 미치게 되므로 Septum의 정기적인 교체가 필요하다.
 
 
 
 
 
 
 
　
 
　
 
　
 
　
 
　
 
 
 
  
 
 
Septum Bleed 뿐만 아니라 Injection(주입구) 표면을 오염시키거나 column을 막음으로써 실험에 오차를 더할 수도 있다. 이는 생물학적 시료의 분석 시에 단백질 찌꺼기와 그외 비휘발성 성분들 때문인데 유리섬유가 채워진 Liner의 사용으로 방지하고 또한 매일의 작업이 끝난 후 교체하여 청결을 유지하도록 해야 한다.
 
 
왼쪽 :    Contaminated Septa 
 
오른쪽: Clean Septa
 
 
 
기화를 빠르게 하기 위해 주입구의 온도는 높아야 하는데, 온도설정에 대해서는 시료 성분 중 가장 높은 끓는 점을 갖는 성분의 그 끓는 점보다 25℃ 높게 지정하는 것으로 되어 있으나 이러한 정보는 별로 도움이 안된다. 우리는 끓는 점이 얼마인지, 또 가장 높은 끓는 점을 갖는 성분이 어느 것인지 잘 알 수 없기 때문이다. 온도의 설정은 분석상의 문제를 고려하여 잘 판단해야 하겠지만 크로마토그램상에서 피크가 넓게 나타날 때까지 주입부의 온도를 낮추면서 계속 시료를 주입해 보면 온도 설정에 대한 판단에 도움이 된다.
　
 
 Column(분리관)
 
　
 
시료가 주입부를 지나서 Column(분리관)에 들어가게 되면 분리가 일어나게 된다
 
시료를 각각의 단일 성분으로 분리하는 것은 전적으로 분리관에서 일어나는 것이므로, 분리관이야말로 기체 크로마토그래프의 심장부라고 할 수 있다. column(분리관)은 과거 분석자가 충전해서 사용하는 packed column이 사용되었으나, 현재는 다양한 충전물을 코팅한 capillary column이 주로 사용되고 있다.
 
　
 
　
 
고체상 지지체는 액상을 지지할 수 있는 비활성의 넓은 표면적을 제공해야 하기 때문에 고체상 지지체 자체는 성분을 흡착하지 않아야 하며 용제에 의하여 석회화된 Silica(규조토)로서 그 입자간의 균일한 모양과 크기를 사용하는 것이 바람직하다.
　
 
 
 
 
 
 
 
고정상은 분리관의 주기능을 담당하는 부분으로 고정상으로 시료가 들어가서(또는 흡착되어) 뒤이어 기화가 일어나는 분배의 연속과정으로 설명할 수 있다. 고정상에 대한 시료의 친화력은 각 시료 성분이 분리관에 얼마나 오랫동안 머무르는가를 결정한다.
 

시료 성분 중 고정상에 친화력이 가장 작은 성분이 가장 먼저 분리되고, 친화력이 가장 큰 성분이 가장 나중에 분리된다. 고정상으로 이용되는 물질들은 다양하며, 이들은 크게 극성과 비극성으로 구분된다. 고정상을 선택할 때에는 고정상에 대한 시료의 친화성 뿐만 아니라 고정상에 대하여 설정할 수 있는 최대 온도를 염두에 두어야 한다.
 
　
 
Column(분리관)을 처음 설치할 때에는 Conditioning이 필요하다. 처음 제조된 Column(분리관)에는 공기, 액상에 포함된 불순물, 코팅과정에서 남아 있게 된 용액, 그리고 그외 바람직하지 못한 폐물 등이 포함되어 있다. Conditioning은 이러한 물질들을 제거하고 Column(분리관)을 분석에 사용할 수 있도록 처리하는 과정이다. 운반기체를 Column(분리관)으로 흘려보내며 100℃에서 1시간 동안 가열하여 대부분의 남아 있는 용매들이 제거되도록 한 다음, 온도를 액상에 설정될 수 있는 최대온도보다 약간 낮은 온도까지 올려서 하룻밤동안 Conditioning한다.
 
 
 
Column(분리관)은 크로마토그램으로부터 효율과 해상도 측정으로 성능을 평가할 수 있다. 효율이란 크로마토그램상의 피크를 어느 정도로 좁게 낼 수 있는가에 관한 능력을 뜻하며, 해상도는 인접한 피크들을 다르다고 식별할 수 있는 능력을 뜻한다. 이 둘간의 관계는 매우 밀접해서 만일 분리관의 효율이 우수하여 아주 좁은 피크로 검출된다면 이는 효율이 좋지 못한 분리관을 사용하였을 때 겹쳐져 나오는 성분들을 식별할 수 있게 된다. 여기에서 우리는 생각할 수 있는 것이 만일 효율이 증가될 수 있으면 우리는 보다 짧은 분리관을 사용해서 동일한 해상도를 얻을 수 있으며 이는 분석 시간을 줄일 수 있는 결과를 낳는다. 이와 더불어 가장 좋은 Column(분리관)이라도 기기와 사용자가 기회를 주지 않는다면 보잘 것 없는 것으로 되어버린다는 것을 깨닫는 것이 중요하다.
 
 
 
현대의 분석에서 가장 첨단의 방법으로 fast analysis를 제안하고 있으며, fast analysis 분석기법을 사용할 경우 분석 시간을 약 1/10로 단축시키면서 동일한 분석결과를 얻을 수  있다.
 
 
 
 Detector(검출기)
 
　
 
Column(분리관)을 지나온 운반기체는 기체의 조성이나 열 등의 변화가 있고, 이 변화를 저항값의 변화로 바꾸어주는 장치가 검출기이며, 이 변화를 전기적 신호로 변환시켜 변환된 값이 기록기에서 나타나게 되어 우리는 인식하게 되는 것이다.
 
 
 
검출기의 선택에 있어서 4가지의 특성을 고려해야 한다. response(감응), sensitivity(감도),selectivity(선택성) 그리고 linearity(직선성)이다.
 
　
 
Response(감응)이란 시료에 의하여 생겨나는 신호로서 이상적으로는 이 응답이 시료의 양에 의해서 달라지지만, 실제 분석에 있어서는 시료의 성질에 따라서 상당히 변화한다. 시료의 양에 따라 감응이 결정되고 이 데이터를 그래프화하면, 여기서 나타나는  직선의 기울기가 sensitivity(감도)이다. 즉 시료의 양에 대해 어느 만큼 반응을 하느냐라고 볼 수 있다. 감도 값은 전체를 나타내는 값이 아니기 때문에 아주 잘못 이해될 수가 있다.
 
　
 
모든 전기회로는 어느 정도의 Noise을 내는데, 감도가 높을수록 심한 경향이 있다. 잡음 정도가 심하거나 시료의 농도가 낮을 때에는 크로마토그램상에서 시료의 피크를 찾기가 어려운데 이는 시료 피크가 바탕선에 파묻혀 버리기 때문이다. 따라서 감도와 함께 생각해 보아야 할 것이 noise ratio(잡음비)이다. Noise에 대한 신호, 즉 바탕선의 폭에 대한 Peak의 높이가 최소 2 이상은 되어야 한다. 신호Noise Ratio가 2일때 시료를 무게의 단위로 나타낸 것이 최저검출수준이며 감도를 수치로 나타낸 것이라고 할 수 있다.
검출기는 특정성분에 대해서 선택적 검출을 한다면 감도가 올라간다.
 
 
 
검출기는 시료의 양에 따라 감응의 정도는 증가하는 것이 정상적이지만 어느 이상의 농도가 되면 검출기의 분석능은 더 이상 증가하지 않으며, 그 시점이 검출 한계이다. 그리고 최저측정농도에서 검출한계까지 검출기가 분석할 수 있는 범위를 직선성이라고 한다. 이로 인하여 우리는 검출기의 종류나 농도 수준에 따라서 심각한 정량의 오차가 발생할 수 있다.
 
 
 
 Chromatogram(크로마토그램)
 
 
 
검출기에 도달한 시료 성분은 전기적 신호로 변환되는데 이 신호를 도면으로 기록한 것을 크로마토그램이라고 한다. 이 크로마토그램에서 Absolute Retention Time(ART:절대머무름시간)은 시료의 주입점으로부터 피크(peak)의 최고점까지의 간격을 나타낸 것으로 cm.inch 또는 min 단위로 표시되며, 일정한 시험조건하에서 각 시료성분을 식별할 수 있는 지표로 삼을 수 있다.
 
　
 
크로마토그램에서는 몇 가지 일반적인 사실을 관찰할 수 있다.
1) 공기와 용매를 제외하면, 이것은 최소한 세가지 성분이 들어 있는 혼합물이다.
2) 고정상과의 친화도는 C 성분이 A나 B보다 더 높다.
3) 성분 A와 C는 비슷한 농도이며 둘 다 성분 B 보다는 농도가 낮다.
  
물론 어떤 실험 조건하에서는 위의 세가지 내용 중 일부가, 또는 전체가 그릇된 판단일 수도 있겠다. 위에서 본 시료들은 고정상의 조건에 따라서 얼마든지 바뀔 수 있다.
 
지금까지 기체 크로마토그래프의 구성과 각 부분별 기능에 대해 알아보았으며 분석이 잘 되기 위해서는 시스템의 조건이 최적화되어 있어야만 한다. 마지막으로 실험의 최적화를 위한 크로마토그래피가 갖추어야 할 조건을 나열하여 보았다.
 
 
 
▶참고문헌
1) Supina. W. R., The packed column in gas chromatography,
   Supelco, Inc., 1974
2) Littlewood, Gas chromatography, 2nd ed., Academic press, 1970